Este instituto provincial se crea dentro del Plan General de enseñanza de 1845, enraizado en las «Escuelas Menores» de Salamanca en cuyo edificio se instala, y propugnado por la Universidad de la ciudad. En 1859 crea el Jardín Botánico, para satisfacer las necesidades de la época. A su vez, el colegio Trilingüe, creado en 1534 y abierto en 1554, pasa a formar parte del Instituto de Segunda Enseñanza en 1860. Buscando unas instalaciones dignas de su función, se construyó un nuevo edificio en el Parque de La Alamedilla, en el que nunca llegó a instalarse.
Del edificio de las Escuelas Menores pasó al del Noviciado de los Jesuitas, en 1933, cuando estos fueron expulsados de España. En esta sede impartirá sus clases hasta el curso 1942-43, año en el que pasa a ocupar el ala oeste del edificio Trilingüe. Es en este año cuando recibe su actual denominación de Fray Luis de León. La precariedad de las instalaciones del colegio Trilingüe da lugar a una sostenida preocupación para lograr una nueva sede que reúna las condiciones necesarias para el buen funcionamiento del Instituto. En esta época el Ayuntamiento de Salamanca dona los terrenos donde se construye el nuevo edificio con capacidad para mil alumnos. Estos están en la Avenida de los Maristas, junto al Instituto femenino Lucía de Medrano.
En 1974 el Instituto «Fray Luis de León» se traslada al nuevo edificio. En el curso 1995-96 se inaugura el nuevo Salón de Actos, el Gimnasio y el campo cubierto de deportes y en el 96-97, queda concluida la nueva Biblioteca.
